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    食品中常見病原微生物檢驗技術PPT課件

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    食品中常見病原微生物檢驗技術PPT課件

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    這是食品中常見病原微生物檢驗技術PPT課件,主要介紹了沙門氏菌檢驗技術;血清學分型鑒定;菌型的判定和結果報告;金黃色葡萄球菌檢驗技術;血漿凝固酶試驗的原理;金黃色葡萄球菌的抗原構造和分型;志賀氏菌檢驗技術,歡迎點擊下載。

    我國衛生部頒布的食品微生物指標有菌落總數、大腸菌群和致病菌三項。 致病菌:能夠引起人類發病的細菌。對不同的食品和不同的場合,應該選擇一定的參考菌群進行檢驗。 沙門菌生物學性狀 三、檢驗程序 SN方法:以無菌方式進行多點取樣25g+225ml緩沖蛋白胨水,經37℃水浴4h培養,進行非選擇性增菌;確保瀕于死亡的細菌進行復活。其后移取10ml轉種于盛有100ml四硫磺酸鹽煌綠增菌液,經42±1℃培養20±2h,進行選擇性的增菌;使目的菌優勝出來。將增菌液搖勻,以無菌操作,分別接種DHL和BS平板上于37℃培養24±2h,進行分離培養;使目的菌分離出來。觀察每個平板上的菌落,選取3-5個菌落接種于TSI或尿素酶瓊脂上,于37℃中培養24±2h,進行篩選試驗;將符合沙門氏菌特征的TSI中的培養物,接種于營養瓊脂平板上,37℃中培養24±2h,進行純化培養;選取單個菌落,接種于20E微量生化管中,進行API生化鑒定;同時取單個菌落,在潔凈的玻板上,作血清學鑒定。 四、操作方法 分五個步驟: 1.前增菌 2.選擇性增菌 3.選擇性平板分離 4.生化實驗 5.血清型分型鑒定 四、操作方法 分五個步驟: 1.前增菌:用無選擇性的培養基使處于瀕死狀態的細菌恢復活力;BPW 2.選擇性增菌:使沙門氏菌優勢繁殖,其它細菌受到抑制;SC+TTB SC (亞硒酸鹽胱氨酸增菌液)TTB(四硫磺酸鈉煌綠增菌液) 胱氨酸促生長 四硫酸鈉和煌綠抑菌 氯化鎂和孔雀綠抑菌 適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長, 37℃適合其他沙門菌生長,42℃,18~24h. 為防漏檢宜SC+TTB 3.選擇性平板分離培養:BS+XLD/HE/顯色培基 4.生化試驗:(1)初步生化實驗:三糖鐵實驗 (2)對疑似沙門氏菌繼續作系統生化實驗 最低限度生化實驗:靛基質、尿素、KCN、賴氨酸。 鑒定分離出來的細菌是否符合沙門氏菌的生化譜,可采用API 20E 等成套生化試劑 5.血清型分型鑒定 A-F多價O血清:把ABCDEF各群含有的共同O抗原的抗體混合起來作成混合血清。 位相變異實驗原理:在半固體培養基中加入已知相的血清,使解離出的已知相的菌體和血清發生反應,這樣已知相的菌體就不能運動了,未知相的菌不能和血清發生反應,能夠運動,并被解離出來。 血清學鑒定:特異性診斷血清鑒定到種 (一)增菌培養 前增菌稱取 25 g(mL)樣品放入盛有 225 mL BPW 的無菌均質杯中,以 8 000 r/min~10 000 r/min 均質 1 min~2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打 1 min~2 min。若樣 品為液態,不需要均質,振蕩混勻。如需測定 pH 值,用 1 mol/mL 無菌 NaOH 或 HCl 調 pH 至 6.8±0.2。無菌操作將樣品轉至 500 mL 錐形瓶中,如使用均質袋,可直接進行培養,于 36 ℃±1 ℃培養 8 h~ 18h。如為冷凍產品,應在 45 ℃以下不超過 15 min,或 2 ℃~5 ℃不超過 18 h 解凍。 增菌 輕輕搖動培養過的樣品混合物,移取 1 mL,轉種于 10 mL TTB 內,于 42 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。同時,另取 1 mL,轉種于 10 mL SC 內,于 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。 分離 分別用接種環取增菌液 1 環,劃線接種于一個 BS 瓊脂平板和一個 XLD 瓊脂平板(或 HE 瓊脂 平板或沙門氏菌屬顯色培養基平板)。于 36 ℃±1 ℃分別培養 18 h~24 h (XLD 瓊脂平板、HE 瓊脂 平板、沙門氏菌屬顯色培養基平板) 或 40 h~48 h (BS 瓊脂平板),觀察各個平板上生長的菌落, 各個平板上的菌落特征見表 1。 <國標>檢測沙門氏菌方法分5個步驟:   1.前增菌: 在含有營養的非選擇性培養基中增菌,使受損傷的沙門氏菌細胞恢復到穩定的生理狀態。 沙門氏菌檢測中前增菌的目的是使沙門氏菌恢復其活力。 檢測經過加工的食品中的沙門氏菌需要前增菌主要因為加工過程中沙門氏菌受到損傷而處于瀕死狀態!     2.選擇性增菌 在含選擇性抑制劑的培養基中,樣品進一步增菌。 沙門沙門氏菌檢測中增菌的目的是使沙門氏菌以外的細菌(主要是艾希氏菌屬)受到抑制,而使沙門氏菌得到一定的增殖,提高沙門氏菌的檢出率。   3.選擇性平板分離 劃線接種于: BS和XLD瓊脂平板或HE瓊脂平板各一個,于36+1℃分別培養18—24小時(XLD、HE)或40—48小時(BS)。 這一步采用固體選擇性培養基,抑制非沙門氏菌的生長,提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。 亞硫酸鉍瓊脂(BS瓊脂)上典型特征 木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂上典型特征 HE瓊脂上典型特征 (三)生化試驗 挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落,接種于三糖鐵瓊脂培養基中。在三糖鐵瓊脂內,各菌屬的主要反應結果如表5—3。 表5—2說明在三糖鐵瓊脂內只有斜面產酸同時H2S陰性的菌株可排除,其他的反應結果均有沙門氏菌的可能,同時均有不是沙門氏菌的可能,都需要作進一步的生化試驗,必要時作涂片染色鏡檢(沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌)。 4.生物化學試驗篩選 挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落,接種于三糖鐵瓊脂培養基中。   排除大多數非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培養物菌屬的初步鑒定! 腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果 沙門菌常用生化試驗 靛基質 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基內,沙門氏菌屬的反應結果見表2。   表2說明,在三糖鐵瓊脂內斜面產酸,底層產酸,同時賴氨酸脫羧酶試驗陰性的菌株可以排除。其他的反應結果均有沙門氏菌屬的可能,同時也均有不是沙門氏菌屬的可能。  2 、 接種 蛋白胨水(供做靛基質試驗) 尿素瓊脂(pH7.2) 氰化鉀(KCN) 將已挑菌落的平板儲存于2℃-5 ℃ 或室溫至少保留24h,以備必要時復查。 P150 (1) A1:典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常,按表可判定為沙門氏菌屬。如有2項異常,為非沙門氏菌屬。 (2)A2:補做甘露醇和山梨醇試驗,沙門氏菌靛基質陽性變體兩項實驗結果均為陽性,但需要結合血清學鑒定結果進行判定。 (3)A3:補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌,同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。 (4)必要時進行沙門氏菌生化群的鑒別。 鄰硝基酚β-半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗) (1)原理:乳糖發酵過程中需要乳糖通透酶和β-半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶,因而只能遲緩發酵乳糖,所有乳糖快速發酵和遲緩發酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。 (2)方法:將待試菌接種于ONPG肉湯中,35℃水浴或孵箱孵育18~24h,觀察結果。 (3)結果:呈現亮黃色為陽性,無色為陰性。 (4)應用:可用于遲緩發酵乳糖細菌的快速鑒定,本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內呈現陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性,而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。 腸桿菌科各屬生化反應初步鑒別表 接種三糖鐵瓊脂的同時,還要接種蛋白胨水,pH7.2尿素瓊脂、KCN培養基和賴氨酸脫羧酶試驗培養基及對照培養基各一管,于36+1℃培養18~24小時,必要時可延長至48小時,按表5-3判定結果。沙門氏菌的結果應屬于A1、A2和B1,其他五種反應結果均可以排除。 反應序號A1,典型反應判定為沙門氏菌屬。如果尿素、KCN和賴氨酸三項中有一項異常,按表5-4仍可判定為沙門氏菌,如有兩項異常,則按A3判定為枸櫞酸桿菌。 5.血清學分型鑒定 (五)菌型的判定和結果報告 綜合以上生化試驗和血清學分型鑒定的結果,按照常見沙門氏菌抗原表及其補充表判定菌型,并報告結果。若結果為陰性,則報告為“未發現沙門氏菌”。 目前,對于沙門氏菌的檢驗技術已有很大進展.一些快速檢驗方法已有應用。如熒光抗體技術檢驗食品中沙門氏菌已在國際二得到公認,其些國家作為商品生產的熒光抗體試劑箱.即可應用于沙門氏菌的快速檢驗。我國在這方面也取得一定的進展,如固相載體吸附免疫技術、免疫染色法,酶聯A蛋白染色等快速檢驗方法均具有快速、方便、經濟和準確等特點,還有許多新方法、新技術仍處在實驗和研究階段,有待于我們去研究探討,以便更好服務于實踐。   指示系統 指示效果及可疑菌落特點 BS 葡萄+H2S 黑色有金屬光澤、棕褐或灰色,周圍培基黑或棕色,或不產硫化氫而呈灰綠色 DHL 乳糖+ H2S 乳糖(+):粉紅色,(-):無色半透明 無色半透明,產硫化氫者中心黑色 SS 乳糖+ H2S HE 乳糖+ H2S 乳糖(+):黃色,(-):藍色 藍綠色或藍色,產硫化氫者中心黑色 沙門氏菌檢測 --概述 原理:沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌,無芽孢,一般無莢膜,周生鞭毛(雞白痢和雞傷寒沙門氏菌除外)。兼性厭氧,最適生長溫度37℃。在普通顯微鏡下和在普通培養基中不能與大腸桿菌進行區分。但沙門氏菌不發酵乳糖,在腸道菌鑒別培養基上形成無色透明菌落,而易與大腸桿菌區別。沙門氏菌有著復雜的抗原構造,一般分為菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和毒力(Vi)抗原三種。沙門氏菌屬包括2000個以上血清型,但多數國家從人體、動物和食品中經常分離到有40~50種血清型。 致病性 中毒現象 沙門氏菌檢測 --檢測方法 GB 前增菌,用無選擇性的培養基使處以瀕死狀態的沙門氏菌恢復活力 選擇性增菌,使沙門氏菌得以繁殖,而大多數的其他細菌受到抑制 選擇性平板分離沙門氏菌 生化試驗,鑒定到屬 血清學分類型鑒定。 沙門氏菌檢測 --注意事項 結果記錄 現象觀察:菌落特征、革蘭氏染色、BS瓊脂、HE瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂 常見問題: SC (亞硒酸鹽胱氨酸增菌液) TTB(四硫磺酸鈉煌綠增菌液) MM 亞硒酸鹽抑菌 胱氨酸促生長 四硫酸鈉和煌綠抑菌 氯化鎂和孔雀綠抑菌 適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長, 37℃ 適合其他沙門菌生長, 42℃,18~24h 為防漏檢宜SC+TTB/MM 沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征 第二節 金黃色葡萄球菌檢驗技術 金黃色葡萄球 葡萄球菌 表皮葡萄球菌 屬分類: 腐生葡萄球菌 致病性 葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病,可引發不同程度的急性胃腸炎癥狀,惡心、嘔吐最為突出而且普遍,腹痛、腹瀉次之。 當金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品,如牛奶和奶制品、肉、蛋等,在溫度條件適宜時,經8-10小時即可相當數量的腸毒素。 雪印牛奶中毒事件 2000年6月29日起,日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、酸奶等3種牛奶制品被查出金黃色葡萄球菌毒素,造成1.5萬名消費者中毒 原因是在北海道的奶粉生產工廠(該廠的產品都是先制成奶粉,再在各地工廠還原成牛奶)出現了停電,使生產線上的原料停留過久,所以出現了細菌超標。 2001年以后 - 借助其他公司支援開始分割公司事業。 2002年雪印食品被解散 一、生物學特性 革蘭氏陽性需氧或兼性厭氧菌,為球菌,排列成葡萄狀,無芽孢、鞭毛,不運動;大多數無莢膜。 最適生長溫度37℃,最適pH為7.4,對熱抵抗力較強,80℃30min才能被殺死。 可在10%-15%氯化鈉和40%膽汁中生長 生物學特性 好氧生長的細胞產生接觸酶;產生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶,大多數菌株可水解天然的動物蛋白,例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類如明膠,水解脂類、吐溫類和磷脂蛋白質,并釋放脂肪酸。 所有的毒株產生凝固酶,人和動物來源的菌株通?赡掏、人、馬和豬的血漿。 生物學特性---培養特征 大多數菌株產生類胡蘿卜素,使細胞團呈現出深橙色到淺黃色,色素的產生取決于生長的條件,而且在單個菌株中可能也有變化 可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖,產酸不產氣。甲基紅反應陽性,VP反應弱陽性。   許多菌株可分解精氨酸,水解尿素,還原硝酸鹽,液化明膠。   具有較強的抵抗力,對磺胺類藥物敏感性低,但對青霉素、紅霉素等高度敏感。 致病性 金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌,臨床表現多種多樣,可引起局部化膿感染,也可引起肺炎、胃腸炎、心包炎等,甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。 葡萄球菌皮膚感染 食物中毒癥狀及發生原因: 二、檢驗所需培養基 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 7.5 %氯化鈉肉湯 血瓊脂平板 Baird-Parker 瓊脂平板 腦心浸出液肉湯(BHI) 兔血漿 磷酸鹽緩沖液 營養瓊脂小斜面 革蘭氏染色液 無菌生理鹽水 三、檢驗程序 GB 4789.10-2010標準 第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗; 第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數; 第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數。 第二法 Baird-Parker平板法檢驗程序 第三法 金黃色葡萄球菌MPN檢驗程序 金黃色葡萄球菌的檢測--測定方法 國標方法注意事項 現象觀察:染色鏡檢(形態、染色) 表面光滑的菌落,菌落色素不穩定,但多數為金黃色。 Baird-Parker瓊脂平板(BP平板) 、血平板 、血漿凝固酶試驗 多數產腸毒素的菌株在血瓊脂平板上能形成溶血圈,并能產生血漿凝固酶,這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標。 四、操作方法 1.增菌培養法 (1)檢樣處理 將25g(mL)檢樣加于225mL滅菌生理鹽水中的滅菌器內,制成1:10檢樣混懸液。 (2)增菌培養 吸取液體檢樣5ml,接種于50mL7.5%氯化鈉肉湯50ml進行增菌。 (3)分離培養 將上述培養物,分別劃線接種到 Baird-Parker 平板和血平板。 血平板 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。 Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h 或 45 h~48 h。 檢測步驟---增菌 利用金黃色葡萄球菌耐鹽的特性(可耐受15%的氯化鈉),用含7.5%氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 (4)觀察菌落形態 Baird-Parker 平板、血平板上挑取可疑菌落。 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直徑為 2 mm~3 mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為 淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度,偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落;但無混濁帶及透明圈。 在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、 金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。 檢測步驟---分離 BP平板: 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素 丙酮酸鈉是一種生長促進劑 亞碲酸鹽對除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性,并使菌落產生黑色 卵黃提供營養和有利于觀察卵磷脂環 甘氨酸和氯化鋰對金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。 Baird-Parker氏培養基 - 成分   胰蛋白胨                     10g   牛肉膏                      5g   酵母膏                      1g   丙酮酸鈉                     10g   甘氨酸                      12g   氯化鋰(LiCl·6H2O)                 5g   瓊脂                       20g   蒸餾水                      950mL   PH7.5 Baird-Parker氏培養基 - 增菌劑的配法   30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞蹄酸鉀溶液10mL混合,保存于冰箱內。 Baird-Parker氏培養基 - 制法   將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解。冷至25℃,校正pH。分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂,冷至50℃,每95mL加入預熱至50℃的卵黃亞蹄酸鉀增菌劑5mL,搖勻后傾注平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48h。 檢測步驟---分離 在BP平板上其典型菌落為:圓形,光滑突起,濕潤,直徑2-3mm,顏色呈灰色到黑玉色,邊緣常為淡色(米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色),周圍為一混濁帶,在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感。 偶然會遇到不分解脂肪菌株,除無混濁帶及透明圈外,其他外觀基本相同。 B-P平板 Baird-Parker平板是一種選擇性培養基,在含有氮源的基礎上,補充了促進細菌生長的丙酮酸鈉,又含有抑制劑:亞碲酸鉀,故有較好的選擇性。但對于金葡萄球菌沒有抑制,其能將亞碲酸鉀還原為碲在菌落中心呈黑色,易于觀察;加入卵黃,由于卵磷酯酶陽性特征,其菌落周圍可出現一明顯的沉淀環,以資區別。 根據菌落形態,作出相應的處理或報告。例如:金黃色葡萄球菌呈圓形、有光澤隆起,中部黑色,邊緣灰色有微透明的渾濁帶;革蘭陽性桿菌呈棕黑色,無光澤有時在培養48h后也出現渾濁帶;酵母菌為白色無透明環。 血平板:金黃色葡萄球菌可以產生溶血素,因此在血平板上產生明顯的溶血環。 血平板上其典型菌落呈金黃色,有時也為白色,大而突起,圓形,不透明,表面光滑,有溶血圈。 血平板 (5)革蘭氏染色鏡檢 (6)血漿凝固酶試驗 挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落 1 個或以上,分別接種到 5 mL BHI 和營養瓊脂斜面,36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。 取新鮮配置兔血漿 0.5 mL,放入小試管中,再加入 BHI 培養物 0.2 mL~0.3 mL,振蕩搖勻,置 36 ℃±1 ℃溫箱或水浴箱內,每半小時觀察一次,觀察 6 h,如呈現凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養物作為對照。 也可用商品化的試劑,按說明書操作,進行血漿凝固酶試驗。結果如可疑,挑取營養瓊脂小斜面的菌落到 5 mL BHI,36 ℃±1 ℃培養 18 h~48 h,重復試驗。 檢測步驟--鑒定 金黃色葡萄球菌可以產生凝固酶,因此對其鑒別的主要實驗是測定其凝固酶。 對于凝固不完全的菌株,可以通過一些其他實驗來進一步確認,例如:厭氧葡萄糖發酵、溶葡萄球菌酶敏感性實驗、耐熱核酸酶實驗等。 所有這些實驗不能作為鑒別其產毒與否的依據。 血漿凝固酶試驗 血漿凝固試驗也可采用玻片法。把兔血漿滴加于載玻片的一端,然后用白金耳挑取菌落與血漿充分混勻、在載玻片另一端以生理鹽水代替血漿做陰性對照;旌虾罅⒓从^察,若出現凝塊即為陽性。 病原性葡萄球菌多數產生血漿凝固酶,非病原性的一般不產生。因此,該法是判定葡萄球菌有無致病性的重要指標。 血漿凝固酶試驗的原理 病原性葡萄球菌能產生血漿凝固酶,使血漿中纖維蛋白原變為不溶性纖維蛋白,附于細菌表面,生成凝塊,因而具有抗吞噬的作用。凝固酶試驗對于判定該菌株是否具有致病力,很有幫助。葡萄球菌凝固酶試驗被廣泛地用于常規鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。 葡萄球菌所產生的凝固酶有兩種:結合凝固酶和游離凝固酶。 結合凝固酶(即凝聚因子):是一種結合于菌體細胞壁的酶,它直接作用于血漿中纖維蛋白原,使之變成纖維蛋白,而使葡萄球菌凝集成塊,玻片法陽性結果是由此酶(凝聚因子)所致。 游離凝固酶:是凝血酶原樣物質,不直接作用于血漿纖維蛋白原上,而被血漿中的致活劑(即凝固酶致活因子)激活后,變成耐熱的凝血酶樣物質,此物質可使血漿中的液態纖維蛋白原變為固態纖維蛋白,從而使血漿凝固。試管法的陽性結果為此酶所致。 【方法】 (1)玻片法 (2)試管法 【結果判斷】 (1)玻片法:5~10s內出現凝集者為陽性。 (2)試管法:如有凝塊或整管凝集出現為陽性。4h后無上述現象出現,則放置過夜后再觀察。 【應用】 本試驗僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。 【方法】 (1)玻片法:在1張潔凈玻片中央加1滴9g/L氯化鈉(生理鹽水)溶液,用接種環取待檢培養物與其混合(設陽性和陰性對照) 制成菌懸液,若經10~20s 內無自凝現象發生,則加入兔新鮮血漿1環,與菌懸液混合,觀察結果。 (2)試管法:用生理鹽水將新鮮兔血漿4倍稀釋,取0.5 ml于試管再加0.5ml待測菌濃菌懸液(需做陽性對照及陰性對照。),混勻后置37℃水浴中,每30min觀察1次結果。若3小時內試驗管和陽性對照管出現凝固,陰性對照管(即濃菌液管)不凝固,為陽性;若陰性,繼續觀察到24小時,不凝固者為陰性。 【結果判斷】 (1)玻片法:5~10s內出現凝集者為陽性。 (2)試管法:如有凝塊或整管凝集出現為陽性。4h后無上述現象出現,則放置過夜后再觀察。 【應用】 本試驗僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。 【注意事項】 (1)玻片法:10 秒內觀察結果,如超過10 秒可出現假陽性,因此必須用試管法驗證凝聚因子試驗。 (2)可選擇的玻片凝集試驗法還包括檢測凝集因子和蛋白A的膠乳凝集試驗。但膠乳凝集試驗和玻片凝固酶試驗的結果并不完全一致。 鑒定金黃色葡萄球菌的特異性和靈敏性均高于傳統的玻片凝固酶試驗。 (3)試管法:須制備濃厚的均勻菌懸液,以便觀察結果。 a.試管法葡萄球菌凝固酶試驗陽性者,應見到明顯的纖維蛋白凝膠塊,出現羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固,應判為陰性。 b.如果培養時間超過4H,應考慮以下幾點: Ⅰ.延長培養時間后,有些菌株產生的葡萄球菌激酶(溶纖維蛋白酶),可以裂解凝塊,產生假陰性結果; Ⅱ.如果使用的血漿不是無菌的(或部分不是無菌的),假陽性和假陰性結果均有可能發生; Ⅲ.所用待測菌不純,延長培養時間后,污染菌可能導致假陽性結果。 Ⅳ.所用血漿缺乏纖維蛋白原(脫纖維血漿)。 (4)最好用EDTA 抗凝的兔血漿,不主張用人的抗凝血, 兔血漿凝塊結實,凝固速度快,優于人血漿。 (5)試驗不可在高鹽培養基上的取菌落,因為可能出現自凝或假陽性。 (6)若被檢菌為陳舊的肉湯培養物(超過18~24H),或生長不良,凝固酶活性低的菌株可能檢測不出來。 (7) 當懷疑待測菌是金黃色葡萄球菌時,對玻片凝固酶陰性的結果應做試管法凝固酶試驗確證。玻片法和試管法凝固酶試驗的血漿標準是:必須含有足夠濃度的凝固酶反應因子和纖維蛋白原,必須無溶纖維蛋白活性和無抑制劑。 血清學反應 可用于檢測食物、培養物或濾液等標本中的細菌或腸毒素。血清學反應不僅簡便快捷,而且能對毒素做出最后定型: ①菌體熒光抗體染色法 涂片:食品樣品接種于葡萄糖肉湯培養基,37℃培養24~48小時。用接種環取上述增菌液,涂布于載玻片上。 干燥:每一個培養物涂布3~4個點, 37度培養箱內干燥。 固定:將干燥好的玻片放在克氏固定液中固定3-5分鐘,再將固定的玻片標本放入95%酒精中浸泡1分鐘。 加抗血清:然后充分干燥,用接種環取1環熒光抗血清輕輕加于菌膜上. 反應:然后37度培養箱內作用30分鐘。 沖洗浸泡:取出作好的玻片用0.01mol/L PH7.4 PBS液沖洗玻片上熒光血清,最后將標本放于95%酒精液中浸泡1分鐘左右取出,用熒光顯微鏡鏡檢。 有特異性明亮熒光的為陽性或者菌量在一個視野中有數個或十幾個細菌以上者為陽性。 ②毒素的檢出 金黃色葡萄球菌毒素的檢出有免疫瓊脂擴散法、反向間接血凝法,放射免疫測定法、免疫熒光法、酶聯免疫吸附測定法、A蛋白血凝試驗、核酸探針檢測,乳膠凝集試驗等。 3.腸毒素的測定 動物試驗可用檢樣稀釋液直接作動物試驗或按以下方法將分離菌株培養制備腸毒素。 ①腸毒素的制備: 腸毒素的制備有固體培養法和液體培養法。 ②腸毒素測定: 注射前應先喂給幼貓少量的食物,以便觀察反應。取上清液按幼貓體重每100g 1mL的劑量腹腔注射或加大2—3倍量口服。然后仔細觀察,一般攻毒后0.5~2小時內幼貓發生嘔吐、腹瀉、體溫上升、畏寒等癥狀,經4~5小時后逐漸恢復。同時實驗時用未接種菌的培養基做同樣處理的陰性對照。 第三節 志賀氏菌檢驗技術 志賀氏菌屬(shigella)是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌,通稱痢疾桿菌。 通常志賀氏桿菌(Bacillus,shigae)僅指I型痢疾志賀氏菌。 志賀氏桿菌是日本志賀詰在1898年首次分離得到的,因此而得名。 本屬細菌對理化因素的抵抗力較其他腸道桿菌為弱。對酸敏感,在外界環境中的抵抗力能以宋內氏菌最強,福氏菌次之,志賀氏菌最弱。一般56-60℃經10分鐘即被殺死。在37℃水中存活20天,在冰塊中存活96天,蠅腸內可存活9-10天,對化學消毒劑敏感,1%石碳酸15-30分鐘死亡。 志賀氏菌屬有四個血清組,即A。 B、C、 D。 (1)A群:又稱痢疾志賀氏菌。不發酵甘露醇。有12個血清型,其中8型又分為三個亞型。 (2)B群:又稱福氏志賀氏菌。發酵甘露醇。有15個血清型(含亞型及變種),抗原構造復雜,有群抗原和型抗原。根據型抗原的不同,分為6型。 (3)C群:又稱鮑氏志賀氏菌。發酵甘露醇,有18個血清型,各型間無叉反應。 (4)D群:又稱宋內氏志賀氏菌。發酵甘露醇,并遲緩發酵乳糖,一般需要3~4天。只有一個血清型。 引起食物中毒的主要是福氏志賀氏菌和宋內氏志賀菌。 一、生物學特性 1.形態特性 本屬細菌為兩側平行、末端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌短桿菌。無芽胞,無莢膜,無鞭毛。多數有菌毛。 與腸桿菌科各屬細菌的主要區別為不運動。 分解葡萄糖,產酸不產氣。大多數不發酵乳糖。vp試驗陰性,不分解尿素,不形成硫化氫,不能利用枸櫞酸鹽作為碳源。 2.培養特性 1)需氧或兼性厭氧,但厭氧時生長不很旺盛。 2)對營養要求不高,在普通瓊脂培養基上易于生長。 3)在10℃-40℃范圍內可生長。最適溫度為37℃左右。最適pH值為7.2。 4)在固體培養基上,培養18-24小時后,形成圓形、隆起、透明,直徑2-3mm、表面光滑、濕潤、邊緣整齊的菌落。 3.生化特性 注:+:陽性;-陰性;-/+多數陰性,少數陽性;(+)遲緩陽性;d有不同生化型。福氏志賀氏6型生化特性與A群和C群相似。 4.血清學特性 利用O抗原的復雜性可將志賀氏菌分成A、B、C、D四群,每一群又可利用O抗原進行分型。志賀氏菌四個亞群各具有不同的抗原構造,都是由菌體抗原(O)及表面抗原(K)所組成。 二、檢驗所需器材 檢樣 25 g(或25 mL)樣品+志賀氏菌增菌肉湯225 mL 41.5 ℃±1℃, 16 h~20 h厭氧培養 XLD MAC或志賀氏菌顯色培養基 36 ℃±1℃,20 h~48 h 挑取可疑菌落 TSI,半固體,營養瓊脂斜面 血清學分型 生化鑒定 志賀氏菌屬分群及分型結果 報告 四、操作方法 1.增菌 以無菌操作取檢樣25 g(mL),加入裝有滅菌225 mL志賀氏菌增菌肉湯的均質杯,用旋轉刀片式均質器以8000r/min-10000r/min均質;均質袋用拍擊式均質器連續均質1 min-2 min,液體樣品振蕩混勻即可。于41.5 ℃±1℃,厭氧培養16h-20h。 2.分離 取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養基平板上,于36 ℃±1℃培養20h-24h,觀察各個平板上生長的菌落形態。宋內氏志賀氏菌的單個菌落直徑大于其他志賀氏菌。若出現的菌落不典型或菌落較小不易觀察,則繼續培養至48 h再進行觀察。 志賀氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征 3.初步生化試驗 挑取平板上的可疑菌落;接種三糖鐵和營養瓊脂斜面和半固體培養基各1管。志賀氏菌在三糖鐵培養基中表現為底層產酸、不產氣,斜面產堿,不產H2S。無動力,固體管內沿穿刺線生長。 4.生化試驗 β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。 必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗,也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗。 生化反應不符合的菌株,即使能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集,仍不得判定為志賀氏菌屬。 表2 志賀氏菌屬四個群 4.生化試驗 β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。 除宋內氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌13型的鳥氨酸陽性;宋內氏菌和痢疾志賀氏菌1型,鮑氏志賀氏菌13型的β-半乳糖苷酶為陽性以外,其余生化試驗志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。另外由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似,必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗,也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗,應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株,即使能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集,仍不得判定為志賀氏菌屬。 表2 志賀氏菌屬四個群 5.血清學試驗 挑取三糖鐵瓊脂上的培養物,做玻片凝集試驗。先用四種志賀氏菌多價血清檢查。 P166 表6-8 福氏志賀氏菌各型和亞型抗原和群抗原 表6-9 志賀氏菌屬四個群的生化特征 5、快速診斷法   1.熒光菌球法:適于檢查急性菌痢的糞便標本。將標本接種于含有熒光素標記的志賀氏菌免疫血清液體培養基中,37℃培養4~8小時。如標本中有相應型別的痢疾桿菌,繁殖后與熒光素抗體凝集成小菌球,在低倍或高倍熒光顯微鏡下易于檢出。方法簡便、快速,有一定的特異性。   2.協同凝集試驗:用志賀氏菌的lgG抗體與富含A蛋白的葡萄球菌結合,以此為試劑,測定患者糞便濾液中志賀氏菌的可溶性抗原。 第四節 肉毒梭狀芽孢桿菌檢驗技術 一、生物學特性 1.肉毒梭菌 肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌,形成芽孢,比菌體寬,呈梭狀,為革蘭氏陽性粗大桿菌,兩端鈍圓,無莢膜,周身有4~8根鞭毛,能運動。28~37 ℃生長良好,最適pH6~8,當pH值低于4.5或大于9.0時,或當環境溫度低于15 ℃或高于55 ℃時,肉毒梭菌芽孢不能繁殖,也不產生毒素。 肉毒梭菌加熱80℃,30min或100 ℃ 10min即可殺死。 但其芽孢抵抗力強,煮沸后要6h, 105℃2h,110℃36min,120℃4-5min才能將其殺死。 肉毒梭菌生命力很強,并廣泛存在于自然界,特別是土壤中,易污染食品,于適宜條件下可在食品中產生劇烈的肉神經毒素(又稱肉毒毒素),能引起以神經麻痹為主要癥狀且死亡率極高的食物中毒。 肉毒素是目前所知的最強烈的細菌外毒素。故肉毒梭菌的檢驗目標主要是其毒素。均以毒素的檢測及定型試驗為判定的主要依據。 引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。 在美國以罐頭發生中毒較多,日本以魚制品較多,中國主要以發酵食品最多,如臭豆腐、豆瓣醬、面醬等。 二、檢驗所需器材 三、檢驗程序 P171 圖6-5 毒素檢測 第五節 常見產毒霉菌的鑒定技術 一、鑒別器材 二、鑒別方法 真菌學檢驗 --注意事項 結果報告方式:cfu/g(ml) 培養溫度及時間 稀釋吹吸 培養基的選用 稀釋平板的選擇 關鍵問題的探討 霉菌的直接計數法 第五節、霉菌和酵母菌數 霉菌及其毒素 我國還沒有制定出霉菌的具體指標,鑒于有很多霉菌能夠產生毒素,引起疾病,應該對產毒霉菌進行檢驗。 一、食品中霉菌和酵母菌數的概念:是指食品檢樣經過處理,在一定條件下培養后,經計數所得1g或1mL檢樣中所含的霉菌和酵母菌菌落數(糧食樣品則指1g糧食表面的霉菌總數)。 二、霉菌和酵母菌數的食品衛生學意義 霉菌和酵母菌也作為評價食品衛生質量的指示菌,并以霉菌和酵母菌數作為判定食品被霉菌和酵母菌污染程度的標志,以便對被檢佯品進行衛生學評價時提供依據。目前已有若干國家制訂了某些食品的霉菌和酵母數的限量標準。 三、測定及表示方法 食品中霉菌和酵母含量多少的測定,我國食品衛生微生物學檢驗標準規定采用平板培養菌落計效法,培養基必須選擇具有抑制細菌作用的選擇性培養基。培養的溫度一般為25~28℃,培養時間為3~7天。通常以每克(或每毫升)食品所含霉菌和酵母數以cfu/g或cfu/mL表示。 其它指標 微生物指標還應包括病毒,肝炎病毒、豬瘟病毒、雞新城疫病毒、馬立克氏病毒、口蹄疫病毒,狂犬病病毒,豬水泡病毒等;另外,從食品檢驗的角度考慮,寄生蟲也被很多學者列為微生物檢驗的指標。 思考題 1.我國衛生部頒布的食品微生物指標有         、         和         三項。 2. 食品微生物致病菌的具體含義是什么? 3.沙門氏菌檢測中前增菌的目的是        。 4.沙門氏菌檢測中增菌的目的是        。 5.檢測經過加工的食品中的沙門氏菌需要前增菌主要因為        。 6.多數產腸毒素的菌株在 ,并能    ,這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標。 7.志賀氏菌         可分成A、B、C、D四群。 8.肉毒梭菌的檢驗目標主要是         。 5、乳糖初發酵試驗通常在(   )檢測中用到。 A 乳酸菌   B. 酵母菌   C. 細菌總數  D. 大腸桿菌 3、活菌計數法檢測細菌總數應選擇平均菌落數在(。┑南♂尪,乘以稀釋倍數報告之。 A 10~20之間   B. 200~500之間   C. 30~300之間   D. 5~10之間 10、菌落總數檢驗中若有兩個以上稀釋度,其生長的菌落數均在30~300之間,如何報告?

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